生化学(実験手法)

1)クロマチン免疫沈降(ChIP)の原理と概要

Sponsored Link

クロマチン免疫沈降(ChIP)法とは

 クロマチン免疫沈降(Chromatin Immunoprecipitation:ChIP)法とは、あるタンパク質に対する抗体(転写因子やヒストン化学修飾に対する抗体など)を用いることで、タンパク質とDNAの相互作用(結合)を調べることができる非常に便利な手法のことです。ChIPは(チップ)と読みます。

このChIP法では、ある転写因子(DNAに結合して転写を調節するタンパク質)がどの遺伝子を標的(ターゲット)にしているかを調べたり、ヒストンの化学修飾アセチル化メチル化など)の状態を特定の化学修飾されたヒストンに対する抗体を用いることによって調べたりすることができます。

1. クロマチン免疫沈降(ChIP)の原理

 クロマチン免疫沈降(ChIP)では、ゲノムDNA(ゲノムDNAは核内でクロマチン構造を形成しています)に結合している「ヒストン」や「転写因子」などのDNA結合タンパク質をホルムアルデヒドという架橋剤によって固定し、その後、DNAを超音波処理ソニケーション)などによって断片化します。

※タンパク質とDNAの結合が強いヒストンの化学修飾の解析などでは、架橋せずにマイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)を用いた酵素法によって断片化を行うこともあります。

このときホルムアルデヒドによる固定によって、目的タンパク質が結合していない領域のDNA部位は分解されてしまいますが、目的タンパク質が結合している領域のDNA部位は分解されません。

このようにDNAとタンパク質の結合が離れないように固定化し、断片化した後に、目的タンパク質に対する「抗体」を用いて免疫沈降を行います。

※免疫沈降とは、「抗体」を使って、抗体に結合するタンパク質などの抗原を回収する操作のことをいいます。

その後、ホルムアルデヒドによって固定化されていたDNAと目的タンパク質の結合を脱架橋させ、DNAを精製した後、残ったDNAをPCRqPCR(定量PCR)によって検出することによって、目的タンパク質がそのDNA領域に結合していたかどうかがわかります。

2. クロマチン免疫沈降(ChIP)法を使用する例

 それでは実際にイメージをもっていただくために、クロマチン免疫沈降法を用いた実験を例を示しながら説明していきたいと思います。

 一般的に、ある遺伝子のプロモーター領域におけるヒストンのアセチル化は、遺伝子発現を促進することが知られています。そこで、薬剤Xを加えた時に、脂肪細胞における遺伝子Aのプロモーター領域で、ヒストンがアセチル化の修飾を受けるかどうかを調べてみましょう。

 まずは、薬剤Xを加えていない脂肪細胞(コントロール)と薬剤Xを加えた脂肪細胞をホルムアルデヒド(架橋剤)で処理し、固定します。その後、超音波処理でDNAを断片に切断します。アセチル化ヒストンに対する抗体を用いて、免疫沈降を行うと、アセチル化されているヒストンに結合しているDNAのみが回収できます。

※このとき、抗体はプロテインAプロテインGといった抗体(抗体のFc領域)に結合するタンパク質を樹脂に固定化したビーズを用いて回収します。

その後、脱架橋して、「フェノール・クロロホルム抽出」あるいは「DNA精製キット」を使用して、DNAを精製します。最後に、得られたDNAを遺伝子Aのプロモーター領域を挟むプライマーを用いて、PCRやqPCR(リアルタイムPCR)で増幅させます。

アセチル化ヒストンに対する抗体で回収していますので、得られたDNAの領域ではヒストンがアセチル化修飾を受けていると考えられます。

そのため、コントロールと比較して薬剤Xを加えた脂肪細胞で、PCR後にDNA断片が強く検出された場合には、「薬剤Xを加えた時に、脂肪細胞における遺伝子Aのプロモーター領域で、ヒストンがアセチル化の修飾を受けている」ということが示唆されます。

3. クロマチン免疫沈降(ChIP)の応用

 クロマチン免疫沈降(ChIP)法を応用させた実験手法として、あるタンパク質(転写因子や化学修飾されたヒストン)が結合するDNA配列を網羅的に調べる「ChIP-seq(クロマチン免疫沈降法と次世代シーククエンシング法を組み合わせた手法)」という手法がよく使われます。マイクロアレイ法をベースにした「ChIP-on-ChIP(クロマチン免疫沈降法とマイクロアレイ法を組み合わせた手法)」もあります。

※マイクロアレイ法については「2)遺伝子発現の網羅的解析(マイクロアレイ法)」で解説していますので、見てみてください。

これらの遺伝子発現解析の手法では、転写因子などの調節タンパク質が、ゲノム内でどのように反応するかをゲノム全体に渡って解析する(これをゲノムワイド解析といいます)ことができるのが特徴になっています。

クロマチン免疫沈降(ChIP)の原理と概要についてはこれで以上です。
次は「2)共免疫沈降法(Co-IP)の原理と概要」について学んでいきましょう。

Sponsored Link

-生化学(実験手法)

© 2020 Bio-Science~生化学・分子生物学・栄養学などの『わかりやすい』まとめサイト~