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2)RT-PCRによるRNAの検出

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1.RT-PCRとは

 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)とは、RNAを鋳型としてDNAを合成(これを逆転写といいます)した後に、特定のプライマーを用いたPCRにより増幅させる操作のことをいいます。このRT-PCRはRNAを検出するために広く用いられている手法になります。逆転写反応により合成されたDNAはRNAと相補的な配列をもつことから、cDNA(complementary DNA;相補的DNA)と呼ばれています。

 mRNAと相補的な配列をもつcDNAは、遺伝子をコードするDNA領域が選択的スプライシングを受けることで、イントロンが除かれエキソンのみとなったものです。

 通常のPCRでは、鋳型となるDNA配列上の特定の領域(目的のDNA領域)を増幅させることはできますが、RNAを直接増幅させることはできませんこれは、DNAはDNAポリメラーゼとプライマーがあれば増幅させることができますが、RNAを合成する際には、プロモーター配列が必要であり、プロモーター配列の下流から転写された(DNAから合成された後の)RNAは、もはや鋳型として働くことができません。そのため、RNAを増幅させるためには、一旦cDNAの形に変換してからPCR(これをRT-PCRといいます)を行う必要があります。

 このようにRT-PCRは、cDNAを用いてPCRを行う方法になりますが、RT-PCRを行うことによって、少量しか存在しないようなmRNAを増幅して解析することが可能です。また、リアルタイムqRT-PCR法を用いることによって、定量的に遺伝子発現の解析を行うことができます。

※ちなみに、RT-PCRの RTはReverse Transcriptionであり、Real timeの略ではないので注意しましょう。qRT-PCRのqは定量という意味です。

2.RT-PCRの原理

 RT-PCRでmRNAをcDNAに変換するためには、まずRNAのみを細胞から抽出する必要があります。その後、抽出したtotal RNAからmRNAのみを選択的に逆転写しcDNAとします。このときに、mRNAのみと選択的にアニールするプライマーとしてオリゴdTプライマー(Tが重合したプライマー)が使用されます。

 その後、目的配列を挟むように設計した一対のプライマーを用いたPCRにより、目的のcDNA配列を増幅させ、電気泳動によって検出します。

 例えば、ガン細胞と正常細胞で特定の遺伝子の遺伝子発現がどのくらい変化しているかを定量的に調べたい場合には、リアルタイムPCRを用いたリアルタイムqRT-PCR法を用いることで解析ができます。

※真核生物のmRNAはその3’末端には、ポリA鎖(Aが20~200個重合した構造)が付加されていることから、これとハイブリダイズするオリゴdTプライマーを利用して、totalRNAからmRNAのみを逆転写することができます。

※逆転写の過程でオリゴdTプライマーの他に、ランダムプライマーや遺伝子特異的プライマーが用いられることもあります。

 

RT-PCRによるRNAの検出についてはこれで以上です。
次は「3)リアルタイムPCRによる定量PCR」について学んでいきましょう。

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