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2)ウエスタンブロッティング

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1.ウエスタンブロッティング(WB)とは

 ウエスタンブロッティングとは、SDS-PAGEによって分離したタンパク質を疎水性膜(メンブレン)に転写し、任意のタンパク質に対する抗体を用いて特定のタンパク質を検出する方法です。

 DNAを検出するサザンブロッティングやRNAを検出するノーザンブロッティングにちなんで、タンパク質を検出する方法として「ウエスタンブロッティング」という名前がつけられました。

 ちなみに、ブロッティングとは、ゲル中の物質を電気的にメンブレン膜に転写させる方法のことをいいます。

2.ウエスタンブロッティングの原理と概要

 ウエスタンブロッティングでは、 SDS-PAGE後のゲルにメンブレンを密着させ、分離したタンパク質を電圧をかけてメンブレンに転写させます。その後、一次抗体(特定のタンパク質に対する抗体)を作用させ、次に二次抗体(一次抗体に対する抗体)を作用させますが、二次抗体にはあらかじめアルカリホスファターゼペルオキシダーゼといった酵素を結合させていますので、適当な基質を作用させてその位置で発色あるいは発光させると、タンパク質位置を検出することができます。

 このような原理から、ウエスタンブロッティングではタンパク質の抗原性(抗体と特異的に結合する性質)と分子量の両方の性質を利用して目的タンパク質を検出することができます。そのため、同時に泳動する分子量マーカーのバンドの位置との比較から、予測した分子量とは違う位置でのバンドが得られた場合には、タンパク質の翻訳後修飾の新たな発見につながることもあります。

 さらに、ウエスタンブロッティングでは、サンプル中における目的タンパク質の発現の有無のみではなく、発現量の変化も測定することができます。

○SDS-PAGE

  SDS-PAGEは、ポリアクリルアミドゲルとSDS(強力な界面活性剤)を用いて、分子量に応じたタンパク質の分離ができる電気泳動のことです。

※SDS-PAGEについての詳細は「1)SDS-PAGEの原理と概要」で解説しています。

○メンブレン

 メンブレンとしては、PVDF(ポリフッ化ビニリデン)やニトロセルロースなどがよく使用されます。タンパク質の電荷や疎水性などに応じて、メンブレン表面への結合能力が左右されるため、最適なメンブレンを決定する必要があります。

○ブロッキング

 ウエスタンブロッティングでは、抗体を用いて特定のタンパク質を検出しますが、抗体の非特異的な結合を防ぐために、メンブレン膜への転写後に「ブロッキング」と呼ばれる操作を行います。

 ブロッキング剤としては、BSA(ウシ血清アルブミン)などのタンパク質スキムミルクなどが使用されます。

※ ブロッキング処理で防ぐことができるのは非特異的な反応のみで、目的のタンパク質のエピトープと同じエピトープがある他のタンパク質に抗体が特異的に結合してしまう反応を防ぐことはできません。

3.モノクローナル抗体とポリクローナル抗体

 ウエスタンブロッティングでは、一次抗体としてモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体が使用されます。ここでは、それぞれの抗体の違いについて解説していきます。

○モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の違い

 抗体は、B細胞が分化した抗体産生細胞によって作られます。このときB細胞はヘルパーT細胞から抗原の情報を受け取り活性化され、抗体産生細胞へと分化していきますので、それぞれのB細胞は抗原に対する特異的な抗体を産生する能力をもつことになります。

 B細胞から生じた抗体産生細胞が産生する抗体は、抗原のもつエピトープ(抗原決定基)を認識して特異的に結合します。タンパク質などの大きな抗原には、エピトープが複数ありますので、1つの抗原には可変部の異なる複数の抗体が結合します。 モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の大きな違いは、このような抗原のもつエピトープを一つだけ抗体の標的として認識させるか、あるいは複数のエピトープを抗体の標的として認識させるかの違いにあります。モノクローナル抗体を用いる場合では、1種類の抗体が抗原のもつ1つのエピトープを認識して結合します。一方、ポリクローナル抗体を用いる場合では、複数の抗体が抗原のもつ複数のエピトープを認識して結合します。

 そのため、ウェスタンブロッティングでモノクローナル抗体を用いた場合には、特定のタンパク質を高い特異性で検出することができます。ポリクローナル抗体を用いた場合には多量の非特異的な抗体も含まれることになり、特異性は低くなります。しかしながら、モノクローナル抗体では、1つの一次抗体のみで特定のタンパク質を検出するため、その後の二次抗体による発光や発色が小さくなり、検出感度が低いことが欠点となります。一方、ポリクローナル抗体では二次抗体によって認識できる一次抗体(ポリクローナル抗体)の量が多いため、検出感度は高くなります。

 さらに、モノクローナル抗体の作製には、比較的手間がかかり高価であるといったことからポリクローナル抗体がよく用いられますが、ポリクローナル抗体ではロットごとに抗体の組成が異なってしまうため、実験目的に応じて適切な抗体を選択する必要があります。

※モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の作製については「3)モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の作製」で解説しています。

4.ウエスタンブロッティングとELISA法の違い

 ELISA法とは、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assayの略で、ウエスタンブロッティングと同様に、特定タンパク質に対する一次抗体と一次抗体に対する二次抗体を用いたタンパク質の検出が行えます。

 両者の決定的な違いは、分子量に基づいてタンパク質を分離するかどうかにあります。ウエスタンブロッティングでは、SDS-PAGEによって分子量に応じたタンパク質の分離を行いますが、ELISA法では分子量に応じた分離は行いません。

 また、ウエスタンブロットでは、目的タンパク質が分解を受けて分解物を生じた場合でも、目的タンパク質の分子量の大きさが異なったバンドとして検出することができますが、ELISA法では両者を分離して検出することはできません。

5.ウエスタンブロッティングの応用

 ウェスタンブロッティングでは、ファージに組み込んだcDNAライブラリー由来の発現タンパク質を目的タンパク質に対する抗体で検出することで、目的タンパク質の遺伝子をクローニングをすることができます。

 この原理を利用した方法として、DNA結合タンパク質(転写調節因子など)RNA結合タンパク質特定のタンパク質と相互作用するタンパク質の遺伝子クローニングにも応用することができます。ちなみに、これらの方法は、それぞれサウスウエスタン法」ノースウエスタン法」「ファーウエスタン法(ウエストウエスタン法)」と呼ばれています。

ウエスタンブロッティングについてはこれで以上です。
次は「3)モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の作製」について学んでいきましょう。

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